关键词:
脂质体
结直肠癌
甲基对苯醌
功能性多肽
摘要:
目的:构建具有抗肿瘤作用的甲基对苯醌高效递送系统,通过体外实验探究其抗结直肠癌药效。
方法:(1)采用摇瓶法-HPLC法测定甲基对苯醌在不同pH 0.9%氯化钠溶液介质中的平衡溶解度和油水分配系数。采用MTT法测定甲基对苯醌对HT29、CT26、Caco2、Hela、Hep G2五株肿瘤细胞的细胞毒活性。
(2)根据电荷、疏水性、疏水力矩和细胞穿膜性等因素改造设计胡蜂毒肽TVD,通过溶血毒性、细胞毒性以及二级结构筛选出优化多肽H4,并进一步与DSPE-PEG2000-Mal合成构建具有穿膜功能的多肽载体材料。
(3)采用薄膜水化-超声法制备甲基对苯醌功能化脂质体,通过单因素考察和正交实验优化处方条件,采用HPLC、Litesizer DLS 500纳米粒径电位分析仪和透射电子显微镜对脂质体进行表征。
(4)采用MTT法考察裸药和制剂组对CT26细胞存活率的影响。构建CT26荷瘤小鼠动物模型,通过尾静脉给药方式考察不同制剂对CT26荷瘤小鼠的药效作用。给药10天后,计算抑瘤率和脏器指数;HE染色、ki67和tunel免疫荧光染色考察肿瘤细胞凋亡情况;流式细胞术和免疫组化法考察药物对CT26荷瘤小鼠免疫系统的影响;对肿瘤组织进行转录组测序分析研究药物潜在的作用靶点和机制。
结果:(1)甲基对苯醌在pH为1.2、2.0、5.0、6.7、7.0、7.4的0.9%氯化钠溶液中,12 h的平衡溶解度平均值分别为7.7、8.1、9.3、8.4、9.3、7.9 mg/m L,油水分配系数平均值分别为0.78、0.80、0.83、0.82、0.77、0.82。甲基对苯醌对五株肿瘤细胞的IC50均小于10μM。
(2)通过理论筛选获得了12条胡蜂毒改造肽,12条改造肽N端均加入了半胱氨酸Cys,实验筛选发现设计出的12条改造肽中K1、K2、K4-1、H3、H4和M3在无溶血毒性,其中H3和H4在对正常肠上皮细胞CCD841具有较低细胞毒性的前提下对结肠癌细胞HT29具有较好的细胞抑制作用,其中H4在pH 6.5 50%TFE PBS,偏肿瘤微环境pH的弱酸性条件较pH 7.3 50%TFE PBS和pH 6.5 PBS条件下具有最大的α-螺旋构象,发现了一种在弱酸疏水性环境下存在强螺旋,正常环境下螺旋较弱的H4多肽,将其修饰到DSPE-PEG2000-Mal上合成功能化多肽
DSPE-PEG2000-H4。
(3)通过单因素和正交实验发现甲基对苯醌脂质体(MBQ-Lipo)制备最优条件为水化温度30℃、磷脂与胆固醇之比为5:1、磷脂与MBQ之比为10:1,最优条件制备的脂质体包封率为52.07±3.23%,粒径为191.70±1.20 nm,电位为-12.45±0.50m V,PDI为0.156±0.02。稳定性考察结果发现其在4℃条件下储存30天能保持稳定。制备MBQ-Lipo@H4考察不同DSPE-PEG2000-H4添加量(0.5、0.75、1、2.5、5、7.5和10%)发现添加量越多包封率越小,在1、2.5和5%处包封率相近,其中添加量为1%时粒径较小,电位适中,最终选择添加量为1%开展后续的实验。
(4)体外实验结果表明,针对CT26细胞MBQ-Lipo@H4的IC50为3.83μM,裸药MBQ的IC50为6.45μM,二者相比有显著区别。体内实验MBQ-Lipo@H4可有效抑制CT26荷瘤小鼠的肿瘤生长,抑制率达74.89%,与相同剂量的裸药MBQ(22.44%)有显著区别。HE染色与tunel染色实验发现MBQ-Lipo@H4给药组凋亡现象高于裸药MBQ;通过流式细胞术对荷瘤小鼠肿瘤中免疫细胞的增殖和亚群水平变化进行检测,发现MBQ-Lipo@H4可降低肿瘤组织中CD4+/CD8+的比例;免疫组化发现MBQ-Lipo@H4组小鼠CD8和CD68阳性表达比模型组增加,CD163相对减少。以上对免疫系统的影响证明MBQ-Lipo@H4可通过增强荷瘤小鼠的自身免疫水平发挥抗肿瘤作用。MBQ-Lipo@H4组小鼠器指数与模型组相比无显著差异,说明MBQ-Lipo@H4组的生物安全性较好,但是裸药对荷瘤小鼠的肺部具有一定的损伤作用。转录组测序结果分析发现差异基因主要集中在PI3K-Akt、MAPK和胰岛素传导等信号通路。
结论:通过构建脂质体高效递送系统解决MBQ稳定性差、毒副作用大及体内药效低的问题。本课题设计了具有肿瘤穿透作用的功能性多肽材料DSPE-PEG2000-H4,将其修饰于脂质体表面后提升MBQ的抗肿瘤作用,实现MBQ在肿瘤区域的高效递送,进一步通过转录组研究发现抗肿瘤的作用机制与PI3K-Akt信号通路等癌症相关通路有关。