关键词:
喙尾琵琶甲
肠道真菌
系统发育树
抗菌活性
次级代谢产物
摘要:
目的:本研究采用牛津杯琼脂扩散法对喙尾琵琶甲肠道真菌的代谢产物进行抗菌活性筛选,以优势培养条件对具有强抑制活性,抗菌谱广的真菌进行大规模发酵,以获得抗菌活性物质。方法:1.将喙尾琵琶甲肠道真菌进行小规模固体发酵,提取代谢产物。以9株病原菌包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methieillin-resistant Staphylococus aureus,MRSA)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、黑曲霉、青霉菌、白假丝酵母菌为指示菌,通过牛津杯琼脂扩散法检测肠道真菌次生代谢产物的抗菌活性;结合形态学和分子生物学方法对抗菌活性显著的菌株进行鉴定,并构建系统发育树;并采用5株肿瘤细胞系,对已鉴定的菌株进行抗肿瘤活性测试。2.对抗菌活性显著的7株肠道真菌进行培养条件的筛选。提取不同培养条件下的代谢产物,以6株病原细菌为指示菌,通过牛津杯琼脂扩散法检测各代谢产物的抗菌活性。筛选出具有强抑制活性,抗菌谱广的真菌。3.通过大规模发酵获取活性显著真菌的次级代谢产物,应用超高效液相色谱飞行时间质谱仪(Ultra-performance Liquid Chromatography-Q-TOF-Mass,UPLC-QTOF/MS)技术对真菌的代谢产物进行分析,采用活性追踪法确定其抗菌活性部位。应用薄层色谱法(Thin layer chromatography,TLC)、硅胶柱层析法、凝胶柱层析等技术从活性部位分离纯化单体化合物,结合核磁共振波谱技术对化合物结构进行解析。结果:1.通过牛津杯琼脂扩散法从108株喙尾琵琶甲肠道真菌中筛选出17株具有不同程度的抗菌活性的真菌;选择BPF6、BPF33、BPF47、BPF55、BPF56、BPF100、BPF106共7株抑菌活性显著的真菌进行鉴定;通过ITS测序和Blast比对,7株活性显著真菌归于5个属,真菌BPF6和BPF33与长梗木霉属Trichoderma longibrachiatum的序列相似性达100%,BPF47与深绿木霉属Trichoderma atroviride的序列相似性达100%,BPF55与尖孢镰刀属Fusarium oxysporum的序列相似性达100%,BPF56和BPF100与桔青霉属Penicillium citrinum的序列相似性达100%,BPF106与假枝孢菌Cladosporium pseudocladosporioides的序列相似性达100%。研究结果还显示菌株Trichoderma longibrachiatum BPF6、Trichoderma longibrachiatum BPF33、Fusarium oxysporum BPF55的次生代谢产物具有广谱的抗肿瘤细胞活性。2.通过培养条件的筛选,肠道真菌Trichoderma longibrachiatum BPF6在PDA培养14 d下获取的代谢产物相较其他菌株的代谢产物抑菌谱广,抗菌活性显著,对受试的6株病原菌均有抑制作用,对其中的4株有较强的抑制作用。而肠道真菌Penicillium citrinum BPF100在SDA培养14 d下获取的代谢产物抗菌活性显著,对受试的4株病原菌有较强的抑制作用。3.对喙尾琵琶甲肠道真菌Trichoderma longibrachiatum BPF6、Penicillium ci trinum BPF100进行大规模发酵,应用UPLC-Q-TOF/MS对总提取物进行分析,从Trichoderma longibrachiatum BPF6和Penicillium citrinum BPF100代谢产物中分别推测出10个、23个化合物,并对Trichoderma longibrachiatum BPF6的乙酸乙酯萃取活性部位进行分离纯化,鉴定出1个单体化合物,化合物1为(22E)-5α,8α-Epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol,为麦角甾醇类化合物,据文献报道其具有一定的抗菌、抗肿瘤、抗疟原虫活性。结论:本研究对喙尾琵琶甲肠道真菌的抗菌活性进行了系统的筛选,结果表明喙尾琵琶甲肠道中含有丰富的抗菌活性的真菌资源。选择两株抗菌谱广、抗菌活性显著的真菌进行活性成分的研究,从真菌Trichoderma longibrachiatum BPF6获得1个抗菌活性成分。