关键词:
多元统计
生物信息学
计算机虚拟研究
肠道肿瘤
喙尾琵琶甲
摘要:
目的
结合多种统计分析方法以及相关可视化分析,利用生物信息学手段,进行药用昆虫喙尾琵琶甲抗肠道肿瘤的in silico(计算机模拟)研究,辅以验证实验,实现以下目标:
(1)建立成分-靶点-通路-疾病网络药理学模型,筛选出该虫药的抗肠道肿瘤的活性成分,并提供相应的药理作用机制预测、为进一步深入研究提供依据。
(2)采用统计学方法对验证实验结果进行量化分析与评价。
方法
(1)构建喙尾琵琶甲化合物库:采用文献收集与GC-MS、LC-MS谱图分析相结合的手法解析该虫药所含单体化合物,利用聚类分析模型以进一步筛选、构造化合物结构文本,并检索相应的SMILES化合物线性结构式,构建后续统计分析所需的化合物文本数据库;利用Swiss Target Prediction数据库、Pubchem数据库等大数据检索平台进行数据挖掘,并根据化合物结构的相似度、生物活性的相关性等指标构建多元统计预测模型,以筛选所述虫药成分治疗疾病的潜在靶点。(2)利用相关分析方法在DAVID数据库、Cytoscape软件预测核心靶点及核心信号通路;基于FDR校正方法计算目标蛋白的Q值,并根据Q<0.05进行富集分析,从而构建“化合物-靶点-通路”网络图谱,查询并分析基因功能注释、信号通路的作用功能,采用统计分析的可视化手段如韦恩图、气泡图等总结并探讨其可能作用机制。(3)采用分子对接技术,构建小分子药物与大分子受体间的相互结合构象与可能结合位点,验证所得结论的可靠性。(4)采用单因素方差分析对基于小鼠结直肠癌细胞株(CT26细胞系)的细胞学实验和分子生物学实验结果进行分析,验证in silico结果,总结喙尾琵琶甲抗肠道肿瘤的活性成分及可能作用机制。
结果
(1)根据本研究进行的LC-MS检测结果,进一步对喙尾琵琶甲含有的657个单体化合物进行聚类分析得到5类638种化合物,结合文献报道的GC-MS检测得到的喙尾琵琶甲所含挥发性成分48种,共686个化合物建立化合物文本库以进行后续的建立网络模型。(2)根据“化合物-靶点-通路”网络图谱,喙尾琵琶甲治疗胃肠道肿瘤的作用应是通过主要活性成分Kaempferol(山柰酚)、Fisetin(漆黄素)、Luteolin(木犀草素)、Myricetin(杨梅素)、Gossypetin(棉花皮素)、Quercetagetin(六羟黄酮)、Isorhamnetin(异鼠李素)、Galangin(高良姜素)作用于AKT1、TNF、SRC、EGFR、HSP90AA1、ESR1、PTGS2靶点,从而在肿瘤信号通路(Pathways in cancer)、蛋白聚糖信号通路(Proteoglycans in cancer)、化学致癌-受体激活(Chemical carcinogenesis-receptor activationr)、脂质和动脉粥样硬化信号通路(Lipid and atherosclerosis)和雌激素传导信号通路(Estrogen signaling pathway)等中发挥重要作用。(3)分子对接试验发现:主要活性成分Galangin、Myricetin与靶蛋白VEGFA、AKT1的结合能分别为-5.5,-5.9,-5.6,-6.2 kcal/mol,提示筛选出的活性成分与靶蛋白能稳定结合,并很有可能在治疗胃肠道肿瘤中发挥重要核心作用。(4)体外实验及分子生物学实验结果显示:高良姜素、杨梅素显著抑制CT26细胞株的生长(生长抑制率分别为31.27%-50.03%、44.94%-78.70%,与空白对照组相比P<0.01),并且高良姜素、杨梅素显著下调AKT1的m RNA表达水平(与空白对照组相比P<0.05)、上调PTGS2的m RNA表达水平(与空白对照组相比P<0.05)。
结论
基于多元统计学和生物信息学分析法,可以系统的揭示喙尾琵琶甲治疗胃肠道肿瘤的作用机制可能是通过Kaempferol、Fisetin、Luteolin、Myricetin等成分作用于AKT1、TNF等靶点在肿瘤信号通路(Pathways in cancer)、蛋白聚糖信号通路(Proteoglycans in cancer)、化学致癌-受体激活(Chemical carcinogenesisreceptor activationr)等通路中发挥重要作用。同时,分子对接实验和体外实验结果均验证了基于多元统计学和生物信息学分析法得到的研究发现,即主要活性成分Galangin、Myricetin能与靶蛋白PTGS2、AKT1稳定结合,通过调节AKT1和PTGS2的m RNA表达水平抑制CT26细胞的生长。本研究采用的方法可推广应用于其它多成分多靶点的动植物药物、疾病的网络毒理学和病理生理学等相关研究。